毛竹基因組測序已于2013年完成，通過多種組學(xué)手段挖掘出大量與重要經(jīng)濟性狀相關(guān)的候選基因。但由于缺乏穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，目前尚未有基因在毛竹體內(nèi)得以驗證。
近日，中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所(以下簡稱亞林所)在毛竹遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯技術(shù)方面取得突破性進展，并在線發(fā)表于《植物科學(xué)前沿》(Frontiers in Plant Science)。該研究成果利用毛竹未成熟胚為外植體誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽分化，建立了高效離體再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系。在此基礎(chǔ)上，通過啟動子優(yōu)化成功實現(xiàn)了CRISPR/Cas9技術(shù)在毛竹基因組中的精準(zhǔn)編輯。
論文通訊作者、亞林所副研究員喬桂榮說，竹子是重要的森林資源之一，具有非常重要的生態(tài)、經(jīng)濟和文化價值。由于竹類植物特殊的開花生物學(xué)特性，很難通過有性雜交育種，主要依賴于自然變異選育新品種。
項目組在前期已建立了叢生竹代表竹種麻竹的花藥培養(yǎng)體系，于2014年首次實現(xiàn)了麻竹轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系的建立和應(yīng)用，并獲得了全球首例竹子轉(zhuǎn)基因中間試驗許可。
“毛竹為散生竹代表竹種，在繁殖及生長習(xí)性方面與叢生竹中有所不同，其離體再生體系較叢生竹難度更大。”喬桂榮說，利用毛竹成熟胚可以誘導(dǎo)愈傷組織并分化出不定芽，但仍存在外植體滅菌困難、再生頻率低等問題。
因此，建立高效的毛竹遺傳轉(zhuǎn)化和基因編輯體系，鑒定調(diào)控毛竹重要經(jīng)濟性狀的基因功能，并利用轉(zhuǎn)基因手段獲得目的性狀改良的新品種，在解析調(diào)控毛竹重要經(jīng)濟性狀的分子機理、推進毛竹分子育種進程等方面具有重要意義。
論文共同第一作者、亞林所研究員卓仁英說，該研究成果利用毛竹未成熟胚為外植體，通過不同激素濃度組合處理，最終獲得了愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率分別超過60%和40%的最佳培養(yǎng)基。通過對遺傳轉(zhuǎn)化條件如抗生素篩選濃度、菌液侵染濃度、侵染時間和方式等進行優(yōu)化，轉(zhuǎn)化率可達(dá)5%左右。
研究還克隆了2個毛竹內(nèi)源U3 SnRNA啟動子，通過與水稻U3啟動子比較分析，發(fā)現(xiàn)PeU3.1啟動子驅(qū)動的sgRNA顯示出更高的編輯效率，進而用于毛竹基因組編輯。研究以八氫番茄紅素脫氫酶基因(PDS)為例，在四個拷貝序列中設(shè)計了保守sgRNA位點，結(jié)果顯示85.7%的再生植株在該sgRNA位點發(fā)生了突變，主要以缺失突變?yōu)橹鳎?2.9%的再生植株為pds1pds2純合突變體，表現(xiàn)為白化表型。
該研究建立了較高的毛竹離體再生體系，在毛竹遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)方面取得了突破性進展，成功將CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用于毛竹并實現(xiàn)了精準(zhǔn)編輯，將極大地推動毛竹基因功能研究及轉(zhuǎn)基因育種研究進程。
該研究獲得“十四五”國家重點研發(fā)計劃和中國林業(yè)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費的資助。研究結(jié)果獲得授權(quán)國家發(fā)明專利1件。(李晨)
關(guān)鍵詞： 毛竹遺傳轉(zhuǎn)化體系 毛竹基因組測序 毛竹遺傳轉(zhuǎn)化 基因編輯
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