洪恒飛 科技日?qǐng)?bào)記者 江耘

(相關(guān)資料圖)

腎細(xì)胞癌起源于腎小管上皮的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)的常見腫瘤疾病，發(fā)病原因尚不明確。根據(jù)國(guó)際癌癥研究中心數(shù)據(jù)庫(kù)GLOBOCAN統(tǒng)計(jì)，2020年全球腎細(xì)胞癌的發(fā)病率居惡性腫瘤第14位，死亡率居第15位。其中，中國(guó)新發(fā)腎癌約7.3萬(wàn)例，且仍呈上升趨勢(shì)。

腎透明細(xì)胞癌則是腎細(xì)胞癌中最常見的病理亞型。由于其復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，當(dāng)前多種臨床治療策略的臨床表現(xiàn)仍有待提升。深入刻畫腎透明細(xì)胞癌微環(huán)境中的細(xì)胞組成和基因組調(diào)控特征，對(duì)于理解腫瘤致病機(jī)理和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。

不久前，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院泌尿外科文甲明主任醫(yī)師、王博涵副主任醫(yī)師課題組聯(lián)合西湖實(shí)驗(yàn)室謝琦研究員團(tuán)隊(duì)，利用單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)揭示了腎透明細(xì)胞癌中的關(guān)鍵調(diào)控程序，發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點(diǎn)。相關(guān)研究論文發(fā)表在國(guó)際期刊《細(xì)胞發(fā)現(xiàn)》。

勘察腫瘤微環(huán)境需要打開新視角

由腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及各種因子構(gòu)成的腫瘤微環(huán)境，是非常復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境。腎透明細(xì)胞癌的腫瘤微環(huán)境具有高異質(zhì)性：同一惡性腫瘤在不同患者個(gè)體間或者同一患者體內(nèi)不同部位腫瘤細(xì)胞間以及不同臨床階段中，都存在很大差異，使得靶向治療和免疫治療對(duì)一部分患者初始就不敏感或者最終產(chǎn)生耐藥性。

所謂靶向治療，是指在細(xì)胞分子水平，針對(duì)主要的致癌相關(guān)分子設(shè)計(jì)相應(yīng)的治療藥物，藥物進(jìn)入體內(nèi)后特異性選擇致癌分子發(fā)生作用，下調(diào)受體的表達(dá)或下游基因的活化，達(dá)到程序化逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞分化的能力，或間接靶向腫瘤新生血管，使腫瘤細(xì)胞缺血而死亡。

“腎癌的靶向治療藥物主要有兩大類，一類是以血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體為靶點(diǎn)的酪氨酸激酶抑制劑，另一類是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白。”文甲明介紹，這兩類藥物都能起到抗血管生成的作用，從而治療腎癌。

腎癌的免疫治療主要依靠免疫檢查點(diǎn)抑制劑。免疫檢查點(diǎn)是免疫細(xì)胞產(chǎn)生的調(diào)節(jié)自身免疫功能的蛋白小分子，一類免疫抑制性的分子，可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和廣度，從而避免正常組織的損傷和破壞，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，免疫檢查點(diǎn)成為免疫耐受的主要原因之一。

“無論是單一的抗血管生成靶向藥物，還是單一的免疫檢查點(diǎn)抑制劑，或是兩者聯(lián)用，目前表現(xiàn)都是在部分患者中有一定療效，但在一部分患者無明顯獲益，甚至出現(xiàn)較為明顯的毒副反應(yīng)?！?文甲明說。

近年來，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)飛速發(fā)展，已經(jīng)能夠檢測(cè)出單個(gè)細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)和表觀基因組調(diào)控等多種維度的信息。

文甲明表示，這種單細(xì)胞水平的多維度信息能夠以更高分辨率和更廣的視角來幫助解析組織發(fā)育和疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，或是腎透明細(xì)胞癌腫瘤微環(huán)境的有利勘探工具。

腎透明細(xì)胞癌的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)可及性圖譜 科研人員供圖

從數(shù)萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞中識(shí)別特殊蛋白質(zhì)

此前，國(guó)外科研團(tuán)隊(duì)曾針對(duì)健康的腎臟組織，運(yùn)用單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(scRNA-seq)和單細(xì)胞染色質(zhì)可及性實(shí)驗(yàn)技術(shù)(scATAC-seq)，刻畫過在腎臟發(fā)育過程中基因表達(dá)和表觀基因組調(diào)控的特征，并識(shí)別出驅(qū)動(dòng)腎小管細(xì)胞分化和近端小管上皮細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵調(diào)控因子。

“以往的研究并未在基因組水平刻畫腎透明細(xì)胞癌的特征，聯(lián)合團(tuán)隊(duì)嘗試直接應(yīng)用單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)來解析腎透明細(xì)胞癌，進(jìn)一步打開腎透明細(xì)胞的單細(xì)胞多維度視角?！蔽募酌鞅硎尽?/p>

此次研究中，聯(lián)合團(tuán)隊(duì)具體采用了4例腎透明細(xì)胞癌患者的手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行研究，對(duì)患者的腫瘤組織進(jìn)行了配對(duì)的scRNA-seq和scATAC-seq測(cè)序，分別獲得的38，097和21，272個(gè)單細(xì)胞。

通過單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析，聯(lián)合團(tuán)隊(duì)識(shí)別了多種淋巴細(xì)胞和髓系細(xì)胞亞群聯(lián)合腎透明細(xì)胞癌標(biāo)志基因CA9和拷貝數(shù)變異特征，在兩種數(shù)據(jù)類型中各鑒定出了一個(gè)腫瘤細(xì)胞群體。

“總的來說，實(shí)驗(yàn)獲取的單細(xì)胞中，免疫細(xì)胞是腎透明細(xì)胞癌微環(huán)境中主要的細(xì)胞群體，占比大于70%，腫瘤細(xì)胞只占不到10%，還有一些正常組織細(xì)胞?！蔽募酌鹘榻B。

通過設(shè)計(jì)嚴(yán)格的篩選策略，并結(jié)合公開的人類癌癥基因組圖譜計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)（TCAGA-KIRC），科研人員識(shí)別了4個(gè)腫瘤細(xì)胞特異富集且顯著和病人更差預(yù)后生存相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，具體為蛋白HOXC5、 VENTX、 ISL1和OTP。

基于scATAC-seq捕獲到的染色質(zhì)開放信息，科研人員進(jìn)一步識(shí)別出了這些轉(zhuǎn)錄因子的下游靶基因并構(gòu)建了其表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析發(fā)現(xiàn)，這些轉(zhuǎn)錄因子的靶基因顯著富集于低氧和細(xì)胞增殖信號(hào)通路，且包含多個(gè)在腫瘤細(xì)胞群體中顯著高表達(dá)的基因FXYD2和CRYAB。

此外，結(jié)合先前的scRNA-seq數(shù)據(jù)，科研人員發(fā)現(xiàn)這些靶基因特異性地富集于腫瘤細(xì)胞群體。

發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌潛在治療靶點(diǎn)

為進(jìn)一步調(diào)查這些調(diào)控因子對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，科研人員分別在腎細(xì)胞癌細(xì)胞系和異種移植小鼠腫瘤模型中分別敲低這幾個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，即下調(diào)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)能夠顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

“我們將人源腫瘤細(xì)胞系注射到免疫缺陷小鼠的皮下后產(chǎn)生腫瘤，即為異種移植小鼠腫瘤模型，以模擬腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)能力。”文甲明解釋說。

同時(shí)，結(jié)合國(guó)際公開的小分子化合物擾動(dòng)數(shù)據(jù)庫(kù)LINCS10，科研人員篩選出了2個(gè)已被美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)用于疾病治療的藥物進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)。

科研人員分別在兩個(gè)鑒定出的腎細(xì)胞癌細(xì)胞系培養(yǎng)過程中，將篩選出來的藥物按提前摸索好的濃度加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，作為藥物處理組，同時(shí)在對(duì)照組中向培養(yǎng)基中加入與藥物處理組等量體積二甲基亞楓，藥物處理兩天后，收集藥物處理組和對(duì)照組細(xì)胞，檢測(cè)HOXC5、ISL1和VENTX的轉(zhuǎn)錄水平。

經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，藥物處理組的HOXC5，ISL1和VENTX的轉(zhuǎn)錄水平明顯低于對(duì)照組。基于此，科研人員將敲低了轉(zhuǎn)錄因子的腎細(xì)胞癌細(xì)胞系和對(duì)照組的腎細(xì)胞癌細(xì)胞系，同時(shí)以同樣數(shù)量注射到免疫缺陷小鼠皮下，一段時(shí)間后，敲低轉(zhuǎn)錄因子組的皮下腫瘤明顯小于對(duì)照組小鼠?？蒲腥藛T即認(rèn)為敲低轉(zhuǎn)錄因子能明顯抑制腎細(xì)胞系細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)能力 。

記者了解到，科研人員對(duì)經(jīng)藥物處理組、對(duì)照組的腎細(xì)胞癌細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)藥物處理組與對(duì)照組相比，腎細(xì)胞癌細(xì)胞體外增殖速度明顯減慢。

此外，科研人員刻畫了對(duì)各個(gè)免疫細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄程序和表觀特征，并在腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞亞群間識(shí)別出了多對(duì)具有潛在臨床意義的配體-受體互作對(duì)。

“本次研究描繪了腎透明細(xì)胞癌的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和表觀基因組圖譜，識(shí)別了腫瘤細(xì)胞特異的基因轉(zhuǎn)錄和表觀調(diào)控程序，可為設(shè)計(jì)更有效的治療策略提供新的線索?！蔽募酌鞅硎?。

關(guān)鍵詞： 腎透明細(xì)胞癌