趙梓杉?科技日?qǐng)?bào)記者?劉傳書

合成生物學(xué)研究就像“造汽車”，通過(guò)將各類生物“零部件”設(shè)計(jì)與組裝來(lái)構(gòu)建人工生物系統(tǒng)。生物元件作為“汽車”的基本“零部件”，它的數(shù)量和功能制約著合成生物學(xué)的發(fā)展。針對(duì)合成生物學(xué)元件匱乏這一關(guān)鍵問(wèn)題，定向進(jìn)化能夠利用進(jìn)化這個(gè)“上帝之手”的力量對(duì)已有生物元件進(jìn)行改造和優(yōu)化，使研究者獲得所需的“定制化功能”，是合成生物學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵核心平臺(tái)性技術(shù)。

中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院劉陳立與傅雄飛團(tuán)隊(duì)基于對(duì)微生物在空間上生長(zhǎng)遷徙的定量理解，開(kāi)發(fā)了一種連續(xù)定向進(jìn)化系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱SPACE），形成了簡(jiǎn)便、高效、大規(guī)模定制生物元件的平臺(tái)性能力。SPACE系統(tǒng)利用每個(gè)普通實(shí)驗(yàn)室都有的小小“平板”，將建庫(kù)和篩選生物元件兩個(gè)步驟結(jié)合在一起，從而實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)裝置的高度簡(jiǎn)化，成百上千的定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)可以平行進(jìn)行，一天時(shí)間就可以完成幾十輪的進(jìn)化。上述成果于9月21日在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《Molecular Systems Biology》上發(fā)表。

(資料圖片)

開(kāi)辟連續(xù)定向進(jìn)化的“創(chuàng)新”路徑

傳統(tǒng)的定向進(jìn)化方法一般分為建庫(kù)和篩選兩個(gè)步驟，多輪進(jìn)化往往需要進(jìn)行大量的重復(fù)操作，耗費(fèi)人力物力。2011年美國(guó)哈佛大學(xué)開(kāi)發(fā)了噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)（簡(jiǎn)稱PACE），是定向進(jìn)化領(lǐng)域一個(gè)重大突破。該方法能夠使蛋白質(zhì)在24小時(shí)內(nèi)進(jìn)化60輪，效率是傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化方法的100倍左右，并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程無(wú)需人為干預(yù)，大大節(jié)省了技術(shù)人員的勞動(dòng)成本。目前，該系統(tǒng)已被廣泛應(yīng)用于RNA聚合酶、TALEN、Cas9、堿基編輯器等重要酶類的進(jìn)化改造。

然而，如果要同時(shí)進(jìn)化多個(gè)目標(biāo)蛋白，目前還缺少一種簡(jiǎn)便的定向進(jìn)化技術(shù)/方法；另一方面，PACE系統(tǒng)需要連續(xù)培養(yǎng)裝置（恒化器，chemostat）、復(fù)雜的流速控制與檢測(cè)設(shè)備和一定的操作技巧，因此普通實(shí)驗(yàn)室不太容易開(kāi)展PACE實(shí)驗(yàn)。

通過(guò)借鑒PACE系統(tǒng)中的相關(guān)設(shè)計(jì)，研究團(tuán)隊(duì)將空間尺度引入到了連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)中，建立了空間噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化（Spatial phage-assisted continuous evolution, SPACE）系統(tǒng)。該系統(tǒng)不僅大大提升了系統(tǒng)操作的簡(jiǎn)便性及元件突變體的篩選效率，為連續(xù)定向進(jìn)化開(kāi)辟創(chuàng)新路徑，還具備了合成生物學(xué)領(lǐng)域內(nèi)元件開(kāi)發(fā)優(yōu)化的巨大平臺(tái)型技術(shù)優(yōu)勢(shì)，將為工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)等各方面提供突破性技術(shù)助力。

解析空間進(jìn)化規(guī)律 開(kāi)發(fā)SPACE系統(tǒng)

此前，劉陳立團(tuán)隊(duì)在細(xì)菌遷徙定植研究中取得了重大突破。研究團(tuán)隊(duì)經(jīng)過(guò)5年時(shí)間的大量實(shí)驗(yàn)反復(fù)研究細(xì)菌空間遷徙與進(jìn)化過(guò)程，揭示了物種空間定植的進(jìn)化穩(wěn)定性策略及定量規(guī)律，為定量合成生物學(xué)、生態(tài)學(xué)等提供了全新的理論指導(dǎo)和啟示。相關(guān)成果于2019年發(fā)表于《自然》。

“源于細(xì)菌遷徙定植的研究靈感，我們發(fā)現(xiàn)不同的突變體在群體遷移的過(guò)程中會(huì)相互競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)空間，最終使它們占據(jù)了空間上的不同位置，從而實(shí)現(xiàn)了不同突變體在空間上的分離”，論文通訊作者劉陳立介紹，目前的連續(xù)定向進(jìn)化方法都采用均勻混合的液體體系，對(duì)有益突變體的篩選只能通過(guò)依賴其生長(zhǎng)能力的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間段的積累，使其獲得在群體中的主導(dǎo)地位。

是否能讓不同的突變體之間自發(fā)分離，使篩選過(guò)程變得更容易？

SPACE系統(tǒng)在PACE系統(tǒng)基礎(chǔ)上，利用細(xì)菌-噬菌體共遷移實(shí)驗(yàn)體系，使原本沒(méi)有運(yùn)動(dòng)能力的噬菌體能夠被處于空間擴(kuò)張運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的細(xì)菌攜帶，并廣泛傳播。該共遷移實(shí)驗(yàn)體系與連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)的相似性，將原本體積龐大且需要較復(fù)雜控制的液體連續(xù)培養(yǎng)裝置替換成了普通生物實(shí)驗(yàn)室中最為常見(jiàn)的軟瓊脂平板。

“我們首先基于經(jīng)典的傳染病模型建立了空間擴(kuò)張系統(tǒng)的宿主感染模型，定量解析了細(xì)菌-噬菌體共遷移實(shí)驗(yàn)體系的進(jìn)化動(dòng)力學(xué)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)了不同強(qiáng)度的噬菌體突變體能夠在空間上出現(xiàn)自發(fā)地分離?；谶@個(gè)定量發(fā)現(xiàn)，我們?cè)O(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了SPACE系統(tǒng)?！闭撐耐ㄓ嵶髡吒敌埏w介紹道。

也就是在這樣一塊小小的平板上，SPACE系統(tǒng)能夠利用突變體之間對(duì)優(yōu)勢(shì)空間的競(jìng)爭(zhēng)，實(shí)現(xiàn)不同強(qiáng)度突變體之間自發(fā)的分離，從而能比均勻混合的液體系統(tǒng)更高效地完成篩選過(guò)程。與此同時(shí)，進(jìn)化的成功與否能夠直接通過(guò)布滿平板表面的細(xì)菌表層上肉眼可見(jiàn)的噬菌體感染區(qū)域的大小來(lái)進(jìn)行判斷，無(wú)需借助其他熒光或化學(xué)發(fā)光等指示信號(hào)的檢測(cè)設(shè)備。

在空間系統(tǒng)中如何實(shí)現(xiàn)對(duì)噬菌體感染動(dòng)態(tài)過(guò)程的控制，以及對(duì)進(jìn)化初始條件的選擇是研究過(guò)程中的較大難點(diǎn)。相較于研究團(tuán)隊(duì)前期建立的細(xì)菌空間擴(kuò)展系統(tǒng)，噬菌體的加入使實(shí)驗(yàn)體系變得更加復(fù)雜。在缺乏理論指導(dǎo)的情況下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能由于初始條件的細(xì)微變化而產(chǎn)生較大差異，導(dǎo)致進(jìn)化不能向著需要的方向進(jìn)行。

為了解決這一問(wèn)題，研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)絲狀噬菌體慢性感染的特性，提出了區(qū)別于其他團(tuán)隊(duì)所提出的基于烈性噬菌體感染模型的新模型。并通過(guò)對(duì)噬菌體感染過(guò)程中噬菌體自身的復(fù)制動(dòng)態(tài)、對(duì)宿主細(xì)菌生長(zhǎng)的影響，以及噬菌體感染區(qū)域面積變化等過(guò)程進(jìn)行大量的定量實(shí)驗(yàn)，測(cè)定出其中的關(guān)鍵參數(shù)用于完善模型。

由此建立的定量理論模型，能夠用于預(yù)測(cè)在采用初始不同強(qiáng)度的基因元件時(shí)系統(tǒng)能夠產(chǎn)生的效果，輔助系統(tǒng)中基因線路的設(shè)計(jì)。

?小小“平板”讓生物元件進(jìn)化更快更高效

為驗(yàn)證SPACE系統(tǒng)的有效性，研究團(tuán)隊(duì)利用SPACE系統(tǒng)進(jìn)行了多組并列進(jìn)化實(shí)驗(yàn)。經(jīng)過(guò)定量實(shí)驗(yàn)表征，得到了相比于原始聚合酶，識(shí)別目標(biāo)啟動(dòng)子能力最高可達(dá)原來(lái)的900倍以上的突變體。通過(guò)同時(shí)進(jìn)行的大量進(jìn)化實(shí)驗(yàn)，也讓研究團(tuán)隊(duì)獲得了一個(gè)已定量表征活性的聚合酶突變體庫(kù)，從中能夠得到聚合酶不同的基因突變信息和活性變化數(shù)據(jù)，這將為后續(xù)聚合酶序列-功能相關(guān)的機(jī)理研究提供重要的依據(jù)。

在已有連續(xù)定向進(jìn)化方法的基礎(chǔ)上，該項(xiàng)研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)與模型模擬相結(jié)合的方式定量揭示了宿主細(xì)菌的空間遷移運(yùn)動(dòng)能力對(duì)噬菌體進(jìn)化的作用規(guī)律，在此基礎(chǔ)上利用空間維度發(fā)展了蛋白質(zhì)等生物分子的新型連續(xù)定向進(jìn)化方法，是定量合成生物學(xué)全新研究范式的重要范例。

空間噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng)（SPACE系統(tǒng)）的應(yīng)用展望示意圖 ?

當(dāng)前，可用的生物元件匱乏成為合成生物學(xué)研究中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題，SPACE系統(tǒng)可以在普通實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn)生物元件的大規(guī)模平行進(jìn)化改造，有望為合成生物學(xué)在化工、農(nóng)業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域的應(yīng)用提供豐富的元件庫(kù)儲(chǔ)備。同時(shí)，細(xì)菌空間遷移運(yùn)動(dòng)對(duì)噬菌體進(jìn)化的作用規(guī)律，也將對(duì)于研究更高等的生物，如昆蟲、鳥類的遷徙對(duì)其攜帶的可能影響人類健康的病毒如何進(jìn)化這類生態(tài)學(xué)理論或調(diào)查研究，提供參考和示范。

（研究團(tuán)隊(duì)供圖）

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